这个推文也在电脑里待了快一年了，拖延症患者，今天终于把它发出来了。NMDS分析过程已经R统计-PCA/PCoA/db-RDA/NMDS/CA/CCA/DCA等排序分析教程中写过了。最近又重新看了《Numerical Ecology with R》一书,巩固一下知识，正好重新整理了一下发出来。

目录：

一、数据准备

二、NMDS分析

2.1 vegan::metaMDS()

2.2 NMDS分析-labdsv::bestnmds()

三、绘制NMDS散点图

四、多元统计分析

五、拟合环境变量

5.1 线性拟合-envfit()

5.2 曲面拟合-ordisurf()或surf()

六、参考资料

一、数据准备

此数据为虚构，可用于练习，请不要作他用。

# 1.1 设置工作路径
#knitr::opts_knit$set(root.dir="D:\\EnvStat\\PCA")# 使用Rmarkdown进行程序运行
Sys.setlocale('LC_ALL','C') # Rmarkdown全局设置
#options(stringsAsFactors=F)# R中环境变量设置，防止字符型变量转换为因子
setwd("D:\\EnvStat\\PCA")library(vegan)
library(ggplot2)# 物种组成数据
## 原始计数
otu <- read.csv("otu.csv",header = TRUE ,row.names=1,sep = ",",stringsAsFactors = TRUE)
tail(otu)
dim(otu)## 相对丰度
spe <- data.frame(otu[1:3],sweep(otu[-c(1:3)],1,rowSums(otu[-c(1:3)]),"/"))
tail(spe)# 环境因子数据
env <- read.csv("env.csv",header = TRUE ,row.names=1,sep = ",",stringsAsFactors = TRUE)
tail(env)
dim(env)

图1|otu及分组信息表，otu.csv。行为样品名称，列为otuID和分组信息。

图2|环境因子及分组信息表，env.csv。行为样品名称，列为环境因子和分组信息。

二、 NMDS分析

在PCA、PCoA、CA和NMDS非约束排序方法中，只有NMDS不是基于特征向量的排序方法，不会最大化排序轴所代表的变量方差(可旋转轴，达到PCA的效果，PC1代表最大方差)。NMDS使用相异矩阵，沿预定数量的轴表示观测数据，同时保留观测间的排序关系。vegan::decostand()提供了一系列群落生态学的数据标准化方法。选择"standardize",可使变量的均值为0.方差为1。如果数据中存在较多的0，一般用hellinger。这里选择"total"计算otu相对丰度值，用于进行NMDS分析。有推文[NMDS分析](NMDS分析 - 知乎)提到“NMDS分析对0值不太敏感，即使有较多的0，也可以得到较为稳健的结果”。如果拿不准要选择那种转换方法和距离指数，就在满足分析假设的前提下，把所有分析都做一遍，选择分析效果更好的方法就行，不要让自己陷入纠结，浪费时间。

2.1 vegan::metaMDS()

# 2.1.1 NMDS分析
#??decostand # 查看数据标准化方法介绍。
#??vegdist # 查看可选的距离指数。
set.seed(12345)
pre1 <- cmdscale(vegdist(spe[-c(1:3)]), k = 2) # 也可使用metaMDS()的运行结果作为起始。
pre1 # 作为NMDS随机起始set.seed(12345)
NMDS1 <- metaMDS(decostand(otu[-c(1:3)],method = "total"),# 等于spe[-c(1:3)]# 调用vegdist()计算dissimilarity indices。designdist()还可以指定以相异指数。distance = "bray", engine = "monoMDS",# vegan还可以调用MASS的"isoMDS"进行NMDS分析。trymax = 200,# 设置最大迭代次数,默认20。当出现2个收敛的解或达到最大迭代次数，NMDS分析停止。wascores = TRUE, #wascores()计算变量得分，但数据中存在负值，则无法计算变量得分。k=2, # 样本数需要大于2*k+1。previous.best = pre1) 
NMDS1# 2.1.2 输出结构介绍
#str(NMDS1)
NMDS1$iters # 迭代不到200，结果就收敛了，所以设置的trymax是足够的。
NMDS1$stress # 胁迫系数。
head(NMDS1$points)# 样本得分
head(NMDS1$species) # 若数据中存在负值，则无法计算出物种得分，所以最好选择数据转换后在[0,1]范围内的标准化方法。
## 若标准化后环境因子数据中存在负值，无法计算变量得分。
## 使用sppscores()可使用data原始数据计算变量得分，
## 也可使用不产生负值的标准化方法，如，Max等。
#sppscores(NMDS1) <- spe[-c(1:3)]
#NMDS1$species

# 2.1.3 Shepard diagram：goodness-of-fit,样本/观测点原始距离与NMDS排序结果比较。
pdf("stressplot.pdf",height = 6,width = 12)
gof <- goodness(NMDS1) # 值越大，观测在排序空间的位置与原始位置差距越大
par(mfrow=c(1,2))
stressplot(NMDS1,pch=16,p.col="black",l.col="red",main="Shepard plot") #  R2 = 1-S*S
plot(NMDS1, display="site",type="t",main = "Goodness of fit")
points(NMDS1, display="site",col="red",cex=gof*100) # 气泡越大，观测在排序空间的位置与原始位置差距越大。
dev.off()

图3|Shepard diagram。样本/观测点原始距离与NMDS排序结果比较。胁迫系数表示原始差异的经NMDS排序后产生的变化，变化越小，表示NMDS排序效果越好，越能准确反应样本的原始空间位置或梯度。Non-metric fit R^2=1-stress^2。拟合优度图(右侧)中气泡越大，观测在排序空间的位置与原始位置差距越大。

# 2.1.4  数据提取
## 提取样本坐标数据
points1=NMDS1$points
head(points1)## 提取物种坐标数据
Species1=NMDS1$species
head(Species1)## 提取胁迫系数:表示原始差异的变异
stress1=round(NMDS1$stress,4) # 保留4位小数点
stress1 # 0.1517

图4|样本得分，points1。

图5|物种得分，species1。

2.2 NMDS分析-labdsv::bestnmds()

bestnmds是使用isoMDS()进行NMDS分析，自动使用cmdscale()进行PCoA分析，作为初始随机起始值。

# 2.2.1 NMDS分析
library(labdsv)
dist <- vegdist(spe[-c(1:3)],method = "bray")
set.seed(12345)
NMDS2 <- labdsv::bestnmds(dist,k=2,itr=50,# 使用PCoA的结果作为初始随机起始值。maxit=200,trace=FALSE)
NMDS2

isoMDS()的胁迫系数以百分比形式显示，monoMDS则以分数形式展示。

# 2.2.2  提取分析结果
## 样本坐标
points2 <- matrix(NMDS2$points, nrow = 36, ncol = 2,dimnames = list(rownames(spe),c("MDS1","MDS2")))
head(points2)## 物种得分果-不自动计算物种得分
vare.points <- postMDS(points2, dist) #看函数是对数据进行了PCA旋转,具体的可以自己看函数代码，postMDS.R。
head(vare.points)
species2 <- wascores(vare.points, spe[-c(1:3)], expand=FALSE)
head(species2)###  可以直接使用NMDS2结果计算
species2.2 <- wascores(points2, spe[-c(1:3)], expand=FALSE) 
head(species2.2)
#eigengrad(vare.points, spe[-c(1:3)])## 绘图-两者数值范围不同，但相对位置差不多，上下，左右颠倒了位置。
pdf("bestnmds.species.pdf",height = 6,width = 12,family = "Times")
par(mfrow=c(1,2))
plot(species2)
text(species2,rownames(species2),cex=0.5)
plot(species2.2)
text(species2.2,rownames(species2.2),cex=0.5)
dev.off()## 提取胁迫系数:表示原始差异的变异
stress2=round(NMDS2$stress,2) # 保留2位小数点
stress2 # 15.21%,即0.1521

图6|bestnmds样本得分，points2。

图7|bestnmds物种得分，species2。

图8|不同方法计算物种得分的差异。两者数值范围不同，但相对位置差不多，上下或左右颠倒了位置。

三、绘制NMDS散点图

图就是简单的散点图，会着重介绍一下，如何自定义图例。将两个分类因子的图例合并。

# 3.1 样本分组信息与样本坐标信息合并
mydata1=cbind(points1,spe[match(rownames(points1),rownames(spe)),1:3])
mydata1 mydata2=cbind(points2,spe[match(rownames(points2),rownames(spe)),1:3])
mydata2

# 3.2 自定义图例-用不同颜色展示grazing，depth用颜色深浅(alpha)表示。
library(ggsci)
library("scales")## 3.2.1 颜色选择
mypal = c(pal_d3(palette="category10",alpha = 0.2)(4),pal_d3(palette="category10",alpha = 0.6)(4),pal_d3(palette="category10",alpha = 1)(4))
show_col(mypal) # 查看颜色
mypal## 3.2.2 绘图
p1 <- ggplot(data=mydata1,aes(MDS1,MDS2))+geom_point(data=mydata1,aes(color=Condition),size=4.5,shape=16)+ # size可以修改点大小。scale_x_continuous(limits = c(-0.8,0.8),breaks = seq(-0.8,0.8,0.2))+scale_y_continuous(limits = c(-0.8,0.8),breaks = seq(-0.8,0.8,0.2))+ # scale*设置坐标区间。annotate("text",x=0.7,y=0.7,size=5.75,colour = "black",# x,y设置stress值的放置位置。label="paste('Stress=',0.15)",parse = TRUE)+scale_color_manual(values = mypal,breaks = c( # 自定义分类变量顺序,与颜色顺序对应。"CK-A","LG-A","MG-A","HG-A","CK-B","LG-B","MG-B","HG-B","CK-C","LG-C","MG-C","HG-C"),labels = c("CK","LG","MG","HG",rep("",8)),guide = guide_legend(title=paste("0-10 cm","10-20 cm","20-30 cm",sep = "\n\n\n"),direction = "horizontal",title.position = "left",title.hjust = 0,  # 标题水平偏移title.vjust = 0, # 标题垂直偏移label.position  = "top", # 设置标签放置位置#label.hjust =0,  # 设置图例标签左对齐keyheight = 1, # 图例高度keywidth  = 2, # 图例宽度ncol=4,byrow = TRUE))+theme_bw()+labs(x="NMDS1",y="NMDS2")+theme(# 调整图细节：轴标题，刻度字体大小等。panel.background = element_blank(),panel.grid = element_blank(),axis.title = element_text(size=18,color = "black"),axis.text = element_text(size=16,color = "black"),legend.text = element_text(size=16,color="black"),legend.title = element_text(size=16,colour = "black"),legend.position= "right") 
p1 ## 3.2.3 输出pdf格式图片到本地
pdf("p1.pdf",height  = 6,width = 10,family = "Times")
print(p1)#输出图的depth需自己对齐一下。
dev.off()

图9|设置的渐变颜色，mypal。

图10|NMDS样本散点图，p1.pdf。

颜色超过三种，用渐变色区分分类因子，就不太直观了。所以下面使用不同颜色区分grazing，不同形状区分depth。

# 3.3 自定义图例-颜色区分grazing,形状区分depth。
## 3.3.1 颜色
library(ggthemes) # 更多主题
cols <- mypal[9:12]
show_col(cols)## 3.3.2 绘图
p2 <- ggplot(data=mydata1,aes(MDS1,MDS2))+geom_point(data=mydata1,aes(color=Condition,shape=depth),size=4.5,alpha=0.7)+#stat_ellipse(aes(group=grazing,color=grazing),level = 0.95,linetype=2)+ # 此句可添加置信圈，此函数不能为只有三个点的组添加置信圈。只有三个点的可使用ggforce包添加置信圈。scale_color_manual(values = rep(cols,times=4),breaks = c( # 自定义分类变量顺序,与颜色顺序对应。"CK-A","LG-A","MG-A","HG-A","CK-B","LG-B","MG-B","HG-B","CK-C","LG-C","MG-C","HG-C"),labels = c("CK","LG","MG","HG",rep("",8)))+ scale_shape_manual(values = c(16,17,15),guide="none")+ # ?points查看数字对应点形状theme_base()+labs(x="NMDS1","NMDS2")+annotate("text",x=0.7,y=0.7,size=7,colour = "black",# x,y设置stress值的放置位置。label="paste('Stress=',0.15)",parse = TRUE)+guides(color =guide_legend(override.aes = list(shape =rep(c(16,17,15),each=4)),title=paste("0-10 cm","10-20 cm","20-30 cm",sep = "\n\n\n"),title.hjust = 1.5,title.vjust = 1,label.position  = "left",label.hjust =0,keyheight = 2,keywidth  = 1.8,ncol=3,byrow = FALSE))+ # 设置图例，参数意义可查看函数帮助信息。theme(axis.title = element_text(size=16,color = "black"),axis.text = element_text(size=14,color = "black"),legend.text = element_text(size=14,color="black"),legend.title = element_text(size=14,colour = "black",angle = 90),)  
p2## 3.3.3 输出图到本地
pdf("p2.pdf",height  = 6,width = 10,family = "Times")
print(p2)#输出图的depth需自己对齐一下。
dev.off()

图11|NMDS样本散点图，p2.pdf。

四、多元统计分析

帮助文档中提示分析组间多元变量的差异,ANOSIM与NMDS一般搭配使用。但此数据有两个分类变量(存在嵌套)，选择adonis可以分析两个分类的交互效应。

# 4.1 Permutational Multivariate Analysis of Variance Using Distance Matrices
set.seed(12345)
t1 <- adonis2(spe[-c(1:3)] ~ grazing*depth, data = spe,permutations = 999, method = "bray",by = "terms") # 输出所有terms的检验结果，会受因子顺序影响。##注意区分grazing+depth，grazing*depth和grazing:depth。
t2 <- adonis2(spe[-c(1:3)] ~ grazing+depth, data = spe,permutations = 999, method = "bray",by = "margin") # 输出边际效应
t3 <- adonis2(spe[-c(1:3)] ~ grazing*depth, data = spe,permutations = 999, method = "bray",by = NULL) # 整个模型的检验结果
t1
t2
t3

图12|adonis2多元统计结果，t1。

图13|adonis2多元统计结果，t2。

图14|adonis2多元统计结果，t3。

# 4.2 限制分层置换
set.seed(12345)
t4 <- adonis2(spe[-c(1:3)] ~ grazing, data = spe, permutations =999, strata = spe$depth) # 限制depth置换，检验grazing效应t5 <- adonis2(spe[-c(1:3)] ~ depth, data = spe, permutations = 999, strata = spe$grazing) # 限制grazing置换，检验depth效应
t4
t5

图15|adonis2多元统计结果，t4。

图16|adonis2多元统计结果，t5。

# 4.3 ANOSIM群落结构差异分析-bray index
set.seed(12345)
grazing.anosim <- anosim(spe[-c(1:3)],spe$grazing,permutations = 999,distance = "bray")depth.anosim <- anosim(spe[-c(1:3)],spe$depth,permutations = 999,distance = "bray")
grazing.anosim
depth.anosim

图17|ANOSIM多元统计结果，grazing.anosim。

图18|ANOSIM多元统计结果，depth.anosim。

更多结果解读及绘图，参考R统计-微生物群落结构差异分析及结果解读。

五、拟合环境变量

5.1 线性拟合-envfit()

线性拟合只能拟合物种与环境因子的线性关系。

# 5.1.1 相关性系数
env.cor <- cor(env[-c(1:3)])
env.cor # 选择相关性较低和感兴趣的2个变量作为示例。

图19|环境因子相关系数，env.cor。

# 5.1.2 envfit()线性拟合环境因子
##选择相关性较低和感兴趣的2个变量作为示例。
set.seed(12345)
NMDS1.env <- envfit(NMDS1 ~ TN+TK, env)
NMDS1.env
name <- names(which(apply(spe[-c(1:3)],2,mean) > 0.01)) # otu太多，只展示平均相对丰度大于0.01的otu。

图20|NMDS1环境因子拟合结果，NMDS1.env。

# 5.1.3 绘图
pdf("envfit.pdf",width = 6,height = 8,family = "Times")
plot(NMDS1,display = "sites", xlim = c(-0.8,1), ylim=c(-1,0.8),main = "NMDS species relative abundance",
sub = "Fitted linear: TN + TK")
abline(h=0,lty=2);abline(v=0,lty=2)
text(NMDS1$points,rownames(spe),cex=(1-goodness(NMDS1)),col = "black") #添加样本标签，字体越大，排序结果代表性越好。
text(NMDS1$species[name,],name,cex=0.5,col="red")
plot(NMDS1.env,lwd=1) # 3 arrows
dev.off()

图21|NMDS1环境因子线性拟合图，envfit.pdf。

5.2 曲面拟合-ordisurf()或surf()

环境因子曲面拟合可以在非线性基础上，展示环境因子与排序结果的关联。ordisurf()和surf()使用的是广义相加模型(GAM)。

# 5.2.1 vegan::ordisurf()拟合环境因子到NMDS1排序图中
pdf("ordisurf.pdf",width = 6,height = 8,family = "Times")
set.seed(12345)
plot(NMDS1,display = "sites", type = "n",#xlim = c(-0.8,1), ylim=c(-1,0.8),main = "NMDS species relative abundance",
sub = "Fitted curve: TN(DarkKhaki) + TK(Tomato)")
abline(h=0,lty=2);abline(v=0,lty=2)
points(NMDS1,display = "sites",lwd = 1,col = rep(cols,each=3),# 按grazing设置点颜色。pch = rep(c(16,17,15),each=12))# 按depth设置点形状。
#text(NMDS1$points,rownames(spe),cex= 0.8,col = "black")# 不展示样本标签
text(NMDS1$species[name,],name,cex=0.5,col="black") 
plot(NMDS1.env,lwd=1,col = c("blue")) # 3 arrows
ordisurf(NMDS1~TN, env,add=TRUE,col="#BDB76B",family = "gaussian") # 更多参数设置?ordisurf查看
ordisurf(NMDS1~TK, env,add=TRUE,col="#FF6347", family = "gaussian")
legend(x = 0.1,y=-1,legend = unique(spe$Condition),col = cols,pch = rep(c(16,17,15),each=4),xjust = 0,yjust = 0,# 以左下为基准对齐ncol = 3)
dev.off()## vegan包中还有很多强大的函数，可以看帮助文件进行学习。
tabasco(spe[-c(1:3)],NMDS1) # 将物种按照NMDS结果进行排序并绘制热图。

图22|NMDS1环境因子曲面(GAM)拟合图，ordisurf.pdf。由图可以看出TK与NMDS排序关系是非线性的，而TN是线性的(曲面由平行直线组成)。曲面上标记的是环境因子的数值。

## 5.2.2 labdsv::surf()拟合环境因子到NMDS2排序图中
pdf("surf.pdf",width = 6,height = 8,family = "Times")
set.seed(12345)
plot(NMDS2,col="white")
points(NMDS2$points,lwd = 1,col = rep(cols,each=3),# 按grazing设置点颜色。pch = rep(c(16,17,15),each=12))# 按depth设置点形状。
#text(NMDS2$points,rownames(spe))
text(species2[name,],name,cex=0.5,col="black") 
surf(NMDS2,env$TN,col="#BDB76B",thinplate=FALSE)
surf(NMDS2,env$TK,col="#FF6347",thinplate=FALSE)
legend(x = -15,y=-20,legend = unique(spe$Condition),col = cols,pch = rep(c(16,17,15),each=4),xjust = 0,yjust = 0,# 以左下为基准对齐ncol = 3)
dev.off()

图23|NMDS2环境因子曲面(GAM)拟合图，surf.pdf。番茄色为TK，深卡其布色为TN。此拟合结果显示TK和TN与NMDS2都非线性关系。

两个函数计算出的样本得分、物种得分和环境因子拟合结果差异有一些大。NMDS由于是随机启动的，容易产生次优解。所以NMDS最好进行多次运行。因为涉及随机过程，为保证结果的可重复性，最好运行时设置随机种子。个人觉得还是基于特征分解的PCoA的分析结果更稳定，不受随机的影响，且结果更易解释，《Numerical Ecology with R》中也更推荐PCoA。书中提到PCoA等的排序结果，可以作为NMDS的输入，用于将超过2-3D的数据空间，在2-3D的维度展示出来。

数据表和代码可从QQ交流群文件夹中下载，或EcoEvoPhylo公众号后台发送“NMDS详解1”获取。

原文链接：R统计绘图-NMDS、环境因子拟合(线性和非线性)、多元统计(adonis2和ANOSIM)及绘图(双因素自定义图例) (qq.com)

参考资料

手动添加图例：请问ggplot2如何给自己的图增加图例? - 知乎图例设置：https://blog.csdn.net/tanzuozhev/article/details/51108040[NMDS分析](NMDS分析 - 知乎)[生信学习-高通量分析-NMDS分析: 非度量多维尺度分析](https://blog.csdn.net/weixin_53819139/article/details/114133818)R统计-微生物群落结构差异分析及结果解读

R统计-PCA/PCoA/db-RDA/NMDS/CA/CCA/DCA等排序分析教程Borcard, Daniel, François Gillet and Pierre Legendre. Numerical Ecology with R. Use R! Cham: Springer International Publishing, 2018. https://doi.org/10.1007/978-3-319-71404-2.

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