低浓度阿拉特津（ATZ）诱导MCF-7细胞增殖的生物标志物发现及其代谢组学机制探究
文章标题：Integrated metabolomics and transcriptomics analysis reveals new biomarkers and mechanistic insights on atrazine exposures in MCF7 cells
发表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
发表时间：2022年1月
影响因子：6.291
合作客户：农科院质标所
百趣生物提供服务：非靶标代谢组学检测、转录组学检测
1、研究背景
阿特拉津(ATZ)是一种世界范围内广泛使用的除草剂，广泛用于防治高粱、玉米、棉花等作物种植中的禾本科杂草。人类可以通过饮用水和饮食等途径暴露ATZ。前期研究表明，ATZ可在较低的浓度下促进MCF-7乳腺癌细胞增殖，但其相关机制尚不清楚。本研究利用多组学结合分子生物学技术阐明环境相关浓度下ATZ暴露对MCF-7增殖的影响及可能的分子机制，为内分泌干扰物引起的毒性机制提供新见解。
2、研究结果
（1）不同浓度ATZ对MCF-7的增殖效应
通过CCK8试验研究不同浓度（100pM-100μM）ATZ对MCF-7细胞暴露48h后的活力影响。结果显示，与对照组相比，10 nM-100μM ATZ暴露48h后细胞活力显著增加，其中1μM ATZ暴露后细胞存活率最高，达到149.3%（图1）。后续试验选择1μM作为代谢组和转录组分析的暴露浓度。
图1. 不同浓度ATZ对MCF7细胞暴露48h后活力的影响
（2）基于代谢组学揭示ATZ暴露对MCF-7代谢的影响
利用UHPLC-QTOF/MS对细胞内代谢物进行代谢组学分析，研究ATZ暴露后代谢谱的变化。在POS和NEG中分别鉴定到957种和1013种代谢物。百趣解读，作者使用OPLS-DA分析，在正负电离模式下，对照组和ATZ暴露组之间存在明显差异，表明MCF-7细胞的代谢组学特征在ATZ暴露48小时后受到明显干扰（图2）。
图2. POS和NEG离子模式下的OPLS-DA
百趣解读，火山图显示了ATZ暴露组和对照组之间代谢组学差异代谢物的分布。如图3所示，在ESI+和ESI-模式下，93和58种代谢物上调（红色圆圈），27和54种代谢物下调（蓝色圆圈），其他代谢物没有显著变化（灰色圆圈）。
图3. ATZ暴露组和对照组在正离子模式(A)和负离子模式(B)下的火山图
（3）潜在生物标志物鉴定及代谢通路分析
利用京都基因、基因组百科全书(KEGG)数据库和人类代谢组数据库(HMDB)搜索，根据VIP值和P值筛选到34种显著变化的代谢物，主要包括维生素、氨基酸、脂肪酸及其相应的衍生物。使用MetaboAnalyst对差异代谢物（DM）进行代谢组学代谢通路分析，分别在ESI+和ESI-模式下鉴定到9个和8个代谢途径（图4）。这些代谢途径的改变主要包括维生素代谢组学通路（叶酸一碳代谢、生物素代谢、维生素B6代谢、硫胺素代谢）、氨基酸代谢组学通路（甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、赖氨酸生物合成代谢和赖氨酸降解代谢）和脂质代谢组学通路（甘油磷脂代谢，花生四烯酸代谢）。
图4. 在ESI+(A)和ESI模式(B)下ATZ暴露显著影响MCF7细胞的通路
（4）转录组学揭示ATZ对基因表达的影响
RNASeq结果表明，ATZ暴露后对MCF7细胞内基因的表达产生了影响。火山图展示了暴露于1µM ATZ后与对照相比差异基因（DEG）的分布，如图5A所示。在p<0.05和log2FoldChange＞0的条件下共有1784个上调基因和1329个下调基因。显著富集的GO主要与细胞成分有关（如图5B所示）。KEGG通路富集分析显示，百趣解读，DEG主要富集于癌症通路和癌症蛋白聚糖（如图5C，D所示）。
图5. ATZ暴露MCF-7后转录组学分析
（5）DM和DEG的关联网络分析
百趣解读，为了进一步研究转录组水平的代谢反应机制，使用Cytoscape（v3.6.1）构建了ATZ诱导的分子相互作用网络。在该网络中，FTCD(亚胺甲基转移酶环化脱氨酶)和叶酸通过叶酸一碳代谢表现出最显著的变化（如图6所示）。叶酸一碳代谢支持细胞分裂中的多种生理过程，如10-甲酰5,6,7,8-四氢叶酸(THF)合成。THF是叶酸在体内的主要形式，ATZ暴露导致的FTCD的下调可减缓THF的代谢，而MTHFD1表达的增加有助于10-甲酰THF合成和嘌呤合成的增加。叶酸和不同形式的THF参与嘌呤的合成，这与MCF-7细胞增殖过程中需要大量核苷酸是一致的。
图6. DM和DEG的网络分析
此外，ATZ对DNA甲基化发生了重要影响，这一过程受其底物(蛋氨酸和半胱氨酸)、辅因子(叶酸、维生素B12和维生素B6)和中间体(SAM、SAH和同型半胱氨酸)的调节。与百趣生物非靶向代谢组学鉴定出的4种显著变化的代谢物，叶酸、吡哆醛（维生素B6的组成成分之一）、1脱氧D木酮糖5磷酸和S腺苷L高半胱氨酸的结果一致（如图7）。叶酸和吡哆醛可作为ATZ暴露的生物标志物。
图7.由叶酸、7,8二氢叶酸 (DHF)、5,6,7,8四氢叶酸(THF)和反式硫化途径组成的单碳代谢途径
3、研究结论
百趣解读，本研究利用多组学和分子生物学技术阐明环境相关浓度下ATZ暴露对MCF-7增殖的分子机制。基于代谢组学分析，共鉴定出34种显著变化的代谢物，包括维生素、氨基酸、脂肪酸和相应的衍生物。叶酸和吡哆醛为ATZ暴露的潜在生物标志物，叶酸一碳代谢组学通路为显著改变的代谢途径。最后，代谢变化中的关键代谢物和相关差异表达基因调控共同揭示了ATZ暴露后MCF-7细胞增殖的分子机制。该研究为理解内分泌干扰物的毒性效应提供了新的见解。
文/阿趣代谢组学
